干净的一切

您必须拥有一个干净的工作区域来通过DDPCR滴住您的AAV。液滴数码PCR是一个敏感的测定，使交叉污染到无模板控制（NTC）井是常见的。以下是您可以采取的一些步骤来实现干净的NTC：

• 有一个专门的工作台和一套专门的移液器用于ddPCR的设置。
• 在一个单独的区域准备主混合溶液，而不是在你准备稀释样品的地方。
• 将所有试剂等分于单用管，并为每次设置抓住一个新鲜的试剂。
• 擦拭长凳和10％漂白剂的所有耗材。

慢慢吸移

如果您使用的是手动液滴发生器，您将必须小心地将您的液滴从液滴发生器转移到PCR板上。保持高滴数对于计算样品的浓度是很重要的。

即使您使用自动化液滴发生器，您也应该在制作病毒稀释时避免过快吸引。这将减少可能导致污染的气溶胶。

优化您的PCR.

有关PCR参数的良好起点，请参阅锁定AAV滴定上的精英纸(Lock et al.， 2014)。

如果您难以使用这些参数的正负液滴之间的干净分离，请以下是您可以尝试的一些事情：

• 增加循环次数。在多轮放大后，你的荧光振幅将增加，导致你的正滴和负滴更大的分离。建议循环次数不超过50次。
• 减少坡道率。建议使用2C / s的速率，以确保所有液滴中的均匀温度变化，但您可以低至1C / s。
• 将拉伸时间增加到2分钟，变性时间增加到1分钟增加液滴分离(Witte et al.， 2016)。如果你的扩增子超过150个碱基对，这是特别重要的。

虽然我们使用ddPCR进行AAV滴定，但该技术有很多应用。微滴数字PCR非常适合于低拷贝数的检测。因此，它可以用于罕见序列的检测和单细胞分析。它也被用于微生物的检测。一些应用程序包括测量可行的益生菌和检测病原体的传播。

由于其广泛的应用和易于使用，液滴数字PCR正成为PCR实验的一种流行选择。