这个月的问题来自分子生物学论坛(在线在molecularbiology.forums.biotechniques.com)的“实时qPCR/qRT-PCR方法”部分。为了简洁明了，参赛作品经过了编辑。在原帖中保留了具体的产品和制造商，但不代表由生物学技术。
分子生物学技术问答
我如何避免技术复制变异和信号在我的无模板控制?(21619线)
问我在使用植物RNA qPCR时遇到了一些问题。我在无模板对照(NTC)反应中发现了扩增现象，Ct值存在不可接受的技术复制差异。
我尝试了总RNA提取，并使用了Invitrogen公司的Dynabeads，我更喜欢后者，因为通过Nanodrop和Bioanalyzer，我可以获得质量更好的RNA。我使用上标II和oligo(dT)20进行逆转录。我使用的是Stratagene和SYBR Green II的MX3000P系统。基因形成二级结构，基因组被复制。正因为如此，我对底漆设计非常小心，并尝试了几种底漆稀释。加入2.5%的DMSO作用甚微，而使用更多的DMSO则抑制反应。我检查了凝胶的每一步PCR产物的序列。我用合适的引物PCR验证了没有基因组DNA污染。我猜变异来自于低质量的cDNA。我该如何解决这个问题?
一个你看到的扩增可能实际上是引物二聚体，而不是真正的扩增。引物二聚体仍然有熔化峰。如果这是你的问题，你可以试着减少使用底漆的量。
如果正如你所怀疑的那样，问题在于cDNA，你可以尝试使用随机引物和oligo(dT)的混合。Qiagen(凯杰)提供了QuantiTect逆转录酶，Bio-Rad提供了他们的iScript酶。
一个不可接受的重复通常是由移液误差引起的。ROX染料应该因母料的不同而正常化。我得到非常紧密的复制使用Qiagen SYBR绿色母料。
你的仪器校准和运行正常吗?
问我用的是ROX染料。它在纠正信号方面有一点帮助，但它的存在对结果影响不大。我看到了ROX通道，NTC和NTC SYBR绿色信号的熔化曲线。
我试着在Opticon机器上运行了几个车牌，但得到了类似的结果。这些仪器由核心设施的技术人员监控，其他用户尚未报告问题。我试着在培养皿的不同位置运行基因，但仍然得到不同的结果，所以这似乎不是机器的问题。
一个ROX通道不能有熔化峰。熔融峰是由SYBR绿结合dsDNA时荧光变化引起的。当温度上升并融化时，SYBR被释放并停止荧光。ROX不会这样做，因为它不结合DNA。如果你看到水控制的峰值，那就是污染。如果不同的样品有不同程度的污染，这可能会导致差异。
在你制造出一批cDNA后，你是将其稀释用于qPCR还是稀释RNA然后进行cDNA反应?我推荐第一种方法。
问我不稀释RNA，而是逆转录然后稀释cDNA。
一个你的NTC信号可能只来自于引物-二聚体产物，所以它实际上可能是负的。这是常见的二聚体形成时，没有实际模板的引物工作。你也可以在高稀释井中看到这一点，因为几乎没有模板。退火之后，您可以在比扩展步骤更高的温度下添加另一个数据采集步骤。这会融化二聚体，这样你就只能读取特定的信号。
如果你的污染是PCR产物，你可以尝试在qPCR混合物中使用dUTP。利用dUTP, PCR产物将U纳入链中。这样你就可以在激活之前用尿嘧啶- n -糖基酶进行2分钟消化TaqDNA聚合酶。任何有污染的PCR产物都会被消化。
一个你的原始植物提取物中的酚类物质，可能还有多糖，会进入你的RNA样本，损害你的逆转录反应的效力。
问我在81°C后增加了一个额外的荧光读数步骤，消除了NTC放大中的大部分信号。
我想知道这种轻微不同的熔化温度是由二级结构引起的，还是由于cDNA折叠而阻止了我的产品的一致放大。
一个您可能想要探索您感兴趣的目标的剪接变体的可能性。你确定你的目标序列吗?
一个Invitrogen公司有一种叫做Thermoscript的逆转录酶，可以在更高的温度下用来帮助移除二级结构。Qiagen逆转录酶读取二级结构。
一个它被记录在论文中由s.a Bustin (2002, J. Mol. Endocrinol。29:23-39)和Wong和Medrano(2005，生物技术39:75-85) qPCR最大的变异来源是做实验的人。你可能错过了一些简单的东西，比如在分配到反应管之前适当的混合。板和管很容易交叉污染。我建议在你的ntc周围留下空井，把一切都旋转起来。
一个我同意前面的评论:旋涡试剂使用前是关键。来自Eppendorf的白孔板具有更高的反射率，因此它们提供更高的信号，更紧密的复制Cts，而且比其他板更便宜。唯一的缺点是很难看到你已经分配试剂的井。
一个你也可以再次尝试高压灭菌稀释溶液。试剂污染是引起NTC信号的主要原因，通常可疑试剂是稀释水或TE。
一个你可能想把你的样本放入最大回收管中或者使用载体核酸。或者你可以尝试另一种类型的检测，比如TaqMan。
一个通过将检测温度设置在二聚体的熔化温度和目标的熔化温度之间，可以避免引物二聚体信号。
你们在复制中产生可变结果的最可能原因是平板没有正确密封，你们的目标基因表达较低(Ct 35-40, Mx3000P或类似仪器的动态范围比ABI7900差)，或者你们的RNA质量不好。
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