为什么我会在NTC样本中看到放大曲线SignaGen博客188金宝慱亚洲体育APP下载 - 188金宝搏下载手机版,188金宝慱亚洲体育APP下载

由于某些引物序列能够形成可被DNA聚合酶用作底物的结构，产物可以出现在非模板控制（NTC）孔中。这个问题最常见的版本是“引物二聚体”，其中两个qPCR引物中的一些互补性小区域允许产生可扩增结构。许多引物设计工具旨在消除这种可能性，并确保没有引物能够在其自身序列中形成二级结构。通过评估熔融曲线轮廓可识别这种类型的扩增s、作为引物二聚体或非特异性扩增将导致具有不同于正确的qPCR产物的熔融峰的DNA产物。

NTC孔中扩增的第二种解释是早期qPCR实验中扩增的污染PCR产物的存在。当重复使用相同的分析时，尤其是当qPCR完成后打开反应容器时，这是一个重要的问题。一般无菌程序可以避免这一问题，例如反应后不打开容器，或在卫星实验室区域使用单独的设备打开容器，并对实验室空间和设备进行常规去污。熔融曲线可用于确定NTC放大是否由携带污染引起。如果是这种情况，NTC反应中的产物将与预期目标相同，熔体轮廓将相应匹配。如果检测到污染，则应更换所有试剂（底漆、水、qPCR混合物），设备应使用10%漂白溶液去污，并且应在未来的实验中使用无菌程序。使用0.2 U/μL南极不耐热UDG(NEB#M0372)可帮助减轻遗留污染，特别是在遗留污染是一个长期问题或特别敏感的应用场合。