什么是腺相关病毒（AAV）
腺相关病毒（AAV）是一种小型、二十面体、无包膜病毒，属于细小病毒科。它在1965年被发现是腺病毒（Ad）制剂的一种污染物，而辅助病毒（如腺病毒或疱疹病毒）通常是发生生产性感染所必需的。野生AAV具有大约4.7kb的线性单链DNA基因组，具有正负极性。有两个ITR位于两个病毒基因rep（复制）和cap（衣壳）的两侧。Rep基因编码四种调节蛋白：基于分子量的Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Cap基因编码三种结构蛋白（VP1、VP2和VP3），它们以约1:1:10的比例组装，形成约22nm的成熟AAV颗粒。AAV2 DNA末端由145个核苷酸长的反向末端重复序列（ITR）组成，由于其末端125个碱基的多盲性，该序列形成一个特征性的T形发夹结构，允许其通过互补碱基配对自我折叠，形成二级结构，通过自吸链置换机制为病毒DNA复制的启动提供游离3'羟基。AAV不编码自己的聚合酶，因此其复制过程依赖于宿主细胞的聚合酶活性。

什么是重组AAV（rAAV）？
重组AAV是一种人工AAV，不包含任何分别编码病毒复制和结构蛋白的AAV rep和cap基因。rep和cap被一个感兴趣的基因或结构所取代，该基因或结构两侧是ITR，ITR包含复制和包装所需的所有顺式作用元件。尽管AAV拥有4.7kb的基因组，但rAAV的有效包装可以通过大小从4.1kb到4.9kb的结构来实现。

rAAV安全吗？
重组AAV（rAAV）由多种质粒（顺式质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒）组成。顺式质粒和辅助质粒与含有rep/cap基因的质粒没有任何同源区域，阻止通过重组系统产生野生型AAV-2。据我们所知，AAV与任何人类疾病无关。然而，建议充分了解rAAV载体的潜在危害和实验室使用的必要预防措施。病毒可能具有潜在的危险性，这取决于你的基因插入。类似的载体已被批准用于人类基因治疗试验，证明其在体内表达基因的潜在能力。由于这些原因，在生产和处理任何重组病毒时必须谨慎。遵循所有适用于重组DNA研究的指南。在生产或处理重组AAV时，采取适当的安全措施，包括在生物安全柜中工作，穿着实验室防护服、面部防护和手套。

我们提供的rAAV血清型是什么？
血清型根据衣壳结构蛋白的类型进行分类，并决定组织特异性。血清型2（AAV2）是研究最充分的血清型。AAV2具有广泛的组织传染性，是研究中最流行的血清型。血清型5（AAV5）和血清型6（AAV6）具有更特异的组织感染性；AAV5可感染包括中枢神经系统、肝脏和视网膜在内的组织中的细胞，而AAV6可感染包括心脏、肌肉和肝脏在内的组织中的细胞。
目前，我们正在为血清型1、2、3、4、5、6、7、8、金博app9、DJ和DJ/8的rAAV提供rAAV生产服务。我们保证所有rAAV血清型在>1E+13 VG/mL时的最终可交付结果。

一般动物实验应使用多少rAAV？
rAAV的使用量高度依赖于靶组织和给药途径。对于小鼠，每只小鼠的数量将在1E+10~1E+12 VG之间（VG=载体基因组，通过qPCR测量）。然而，确切的剂量应根据经验确定。

什么是无助手rAAV？
由于AAV是一种复制缺陷病毒，其复制依赖于其他病毒，如腺病毒和herps病毒。这些病毒也称为辅助病毒。研究表明，AAV只需要一些辅助病毒产物（E1A和E1B、E2A、E4和VA），它们由另一载体或稳定表达的细胞系以反式形式提供（图1）。

图1。这幅漫画展示了rAAV是如何与无助手系统打包在一起的。

什么是重复和上限？
它们分别是由rep和cap基因编码的复制蛋白和衣壳蛋白。代表包括代表78、68、52和40。代表涉及AAV的复制。CAP含有三种蛋白质，VP1（病毒粒子蛋白1）、VP2和VP3，分子量分别为87、72和62 kDa。这些衣壳蛋白组装成一个由60个亚单位组成的近球形蛋白壳。Caps确定AAV的血清型。

图2。一幅漫画，展示Rep和Cap基因转录和翻译成Rep和Cap蛋白。

如何生产不同血清型的重组AAV？
生产不同血清型重组AAV最常用的方法是杂交反式互补法，其中REP和ITR来自AAV2；辅助质粒E1A和E1B提供的腺病毒蛋白E2A、E4、VA在293细胞中稳定表达。引起AAV血清型的CAP分别来自不同的质粒。

重组AAV的最大插入尺寸是多少？
对于传统的单链rAAV，从ITR到ITR的封装容量为4.5 kb。对于自互补（也称为双链）rAAV，从ITR到ITR的封装容量约为2.3KB。

我应该在实验中使用哪种血清型？
以下是一些基于文献的初步指南。
AAV1：中枢神经系统、眼睛、心脏、肺、骨骼肌
AAV2：中枢神经系统，眼睛
AAV5：中枢神经系统、眼、肺
AAV6：脂肪、心脏、肝脏、肺、骨骼肌
AAV8：脂肪、中枢神经系统、眼睛、肝脏、骨骼肌；
AAV9：脂肪、中枢神经系统、眼睛、心脏、肝脏、肺、骨骼肌

AAV血清型及其趋向性体内

AAV载体的相对体外传染性：

注：感染率标准化为AAV-2=100。ND=未确定

188金宝慱亚洲体育APP下载SignaGen为试点血清型选择研究提供AAV血清型检测试剂盒（cat#SL100886）。请记住，在体外和体内进行的血清型选择研究并不一致。

为什么rAAV感染介导长期和持久的转基因表达？
与野生型AAV不同，重组腺相关病毒（rAAV）载体通常不将其转基因纳入宿主基因组。然而，rAAV仍然能够介导宿主细胞感染后的长期基因表达。据报道，在啮齿类动物的肌肉中，rAAV载体基因组在细胞核中以融合体-外体形式存在，主要以外体单体和融合体环的形式存在。rAAV的外体基因组以典型的核小体模式同化到染色质中。rAAV载体基因组和基因表达在静止组织中持续数年表明，真正的染色质结构对于外体维持和转基因表达非常重要。这些发现来自于肌肉注射5E+12 VG/kg后22个月内用rAAV1和rAAV8载体转导的灵长类动物肌肉（图3）。

图3。这幅漫画展示了rAAV感染介导的长期持续转基因表达的机制。

载体制剂的典型滴度是多少？
对于中试、中型和大型定制金博apprAAV生产服务，我们保证通过qPCR测量，以滴度>1E+13 VG/mL的方式提供rAAV。

如何储存重组AAV制剂？
建议在收到rAAV后进行报价，并储存在-80处⁰C.一份等份解冻后，可在4℃下储存两周。稳定性研究表明rAAV载体在4℃时高度稳定⁰C或更低。避免反复解冻和冷冻。

物理粒子和基因组粒子有什么区别？
与基因组一起成功包装的rAAV颗粒被称为基因组颗粒，基因组颗粒能够转导与其接触的细胞，因此具有功能性，而未包装基因组的rAAV颗粒被称为非功能性物理颗粒。

rAAV基因传递的优势是什么？
rAAV具有产生高滴度病毒的能力，在分裂和非分裂细胞中具有广谱的趋向性，并具有以最小免疫原性进行长期基因转移的潜力。