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什么是adeno相关的病毒(aav)
腺相关病毒(AAV)是属于Parvoviridae家族的小型,IcosaheLal和不共同的病毒。它在1965年发现,通常需要腺病毒(AD)制剂和辅助病毒等腺病毒或疱疹病毒的污染物,通常需要进行生产性感染。野生AAV具有约4.7kb的直链单链DNA基因组或减去极性。两只病毒基因rep(复制)和帽(衣壳)有两种ITRS。Rep基因在分子量的基础上编码四种调节蛋白:Rep78,Rep68,Rep52和Rep40。帽基因编码三种结构蛋白(VP1,VP2和VP3),其以约1:1:10的比例组装,形成成熟的AAV颗粒,其约为22nm。AAV2 DNA Termini由145个核苷酸长的倒置末端重复(ITR)组成,其形成特征性T形发夹结构,这是由于其端子125底座的多种子统计学性质,这允许其通过互补底部配对,形成折叠。提供游离3'羟基的二级结构,用于通过自引发链 - 位移机构引发病毒性DNA复制。AAV不编码其自己的聚合酶,因此其复制过程依赖于宿主细胞聚合酶活性。
什么是重组aav(raav)?
重组AAV是人造AAV,其不含任何AAV批量和帽基因,分别编码病毒复制和结构蛋白。Rep和Cap被基因或兴趣的构建体替换,其侧翼的ITRS,其含有复制和包装所需的所有顺式作用元件。尽管AAV具有4.7 kB基因组,但可以使用范围为4.1kb至4.9kb的构造来进行Raav的高效包装。
rav安全吗?
由几个质粒(CIS质粒,辅助质粒,REP / CAP质粒)组成的重组AAV(RAAV)。顺式质粒和助手不会与含有质粒的REP / Cap-基因分享任何同源性的区域,防止通过重组系统生产野生型AAV-2。对于我们的知识,AAV与任何人类疾病无关。然而,建议充分了解rAAV载体的实验室使用的潜在危害和必要的预防措施。病毒可以取决于您的基因插入件,潜在危险。已批准类似的载体进行人类基因治疗试验,证明了它们在体内表达基因的潜在能力。由于这些原因,必须在任何重组病毒的生产和处理中行使到期谨慎。遵循涉及重组DNA的研究的所有适用指导。在生产或处理重组AAV时采取适当的安全措施,包括在生物安全柜中工作和穿着防护实验室外套,面部保护和手套。
我们提供的rav serotypes是什么?
血清型由衣壳结构蛋白的类型分类,并确定组织特异性。血清型2(AAV2)是最熟练的血清型。AAV2具有广泛的组织感染性,是最受研究目的的最受欢迎的血清型。血清型5(AAV5)和血清型6(AAV6)具有更具体的组织感染性;AAV5可以感染组织中的细胞,包括中枢神经系统,肝脏和视网膜,而AAV6可以感染包括心脏,肌肉和肝脏的组织中的细胞。
目前我们在血清型1,2,3,4,5,6,7,8,9,D金博appJ和DJ / 8中提供RAAV生产服务。我们保证最终可交付的所有RAAV血清型在> 1E + 13 VG / mL。
rav应该用于一般动物实验?
所使用的量raAv量高度依赖于目标组织和给药途径。对于小鼠的小鼠,每只小鼠的1E + 10〜1E + 12 Vg(Vg = v =载体基因组,通过QPCR测量)。但是,应对正义的剂量凭经验确定。
什么是助手免费rav?
因为AAV是一种复制缺陷病毒,所以它的复制取决于其他病毒,如腺病毒和鼠疱疹病毒。这些病毒也称为辅助病毒。研究确定AAV仅需要一些辅助病毒产品(E1a和E1b ,,e2a,e4和va),其由另一个载体或通过稳定表达细胞系(图1)提供。
图1所示。这幅漫画展示了rAAV是如何与一个无助手系统打包的。
什么是代表和帽子?
它们分别是rep和cap基因编码的复制蛋白和衣壳蛋白。代表包括78、68、52和40。Reps涉及AAV的复制。cap含有3个蛋白VP1(病毒体蛋白1)、VP2和VP3,分子量分别为87、72和62 kDa。这些衣壳蛋白组装成一个近球形的蛋白质壳,有60个亚基。Caps确定AAV的血清型。
图2。这幅图显示了Rep和Cap基因向Rep和Cap蛋白的转录和翻译。
如何生产不同血清型的重组AAV?
产生不同血清型的最常用的重组AAV方法是杂交反式补充方法,其中REPS和ITR衍生自AAV2;通过辅助质粒提供的腺病毒蛋白的E2A,E4,VA,E1a和E1b在293个细胞中稳定地表达。引起AAV的血清型的帽子分别来自不同的质粒。
重组AAV的最大插入大小是多少?
对于常规的单链rav,从ITR到ITR,包装容量为4.5 kB。对于自我互补(也称为双链)rav,ITR到ITR的包装能力约为2.3 kB。
我应该在我的实验中使用哪种血清型?
以下是基于文献的一些初步指导。
AAV1:CNS,眼睛,心脏,肺,骨骼肌
AAV2:CNS,Eye
AAV5:CNS,Eye,Lung
AAV6:脂肪,心脏,肝,肺,骨骼肌
aav8:脂肪,cns,眼睛,肝脏,骨骼肌;
AAV9:脂肪,CNS,眼,心脏,肝脏,肺,骨骼肌
aav血清型及其热心体内
血清型 |
CNS / Retina. |
心 |
肺 |
肝脏 |
骨骼肌 |
AAV1 |
X |
X |
X |
|
X |
AAV2. |
X |
|
|
X |
X |
AAV3. |
X |
X |
|
X |
|
AAV4 |
X |
X |
|
|
|
AAV5 |
X |
|
X |
|
|
AAV6. |
|
X |
X |
X |
X |
AAV7. |
X |
|
|
X |
X |
AAV8. |
X |
|
|
X |
X |
AAV9. |
X |
X |
X |
X |
X |
AAV10 |
X |
|
X |
|
|
AAV载体的相对体外感染性:
细胞系 |
AAV-1 |
AAV-2 |
AAV-3 |
AAV-4 |
AAV-5 |
AAV-6 |
AAV-8. |
AAV-9. |
AAV-DJ |
AAV-DJ / 8 |
Huh-7 |
13. |
One hundred. |
2.5 |
0.0 |
0.1 |
10. |
0.7 |
0.0 |
500. |
0.2 |
HEK293 |
25. |
One hundred. |
2.5 |
0.1 |
0.1 |
5. |
0.7 |
0.1 |
500. |
0.3 |
赫拉 |
3. |
One hundred. |
2.0 |
0.1 |
6.7 |
1 |
0.2 |
0.1 |
667. |
0.2 |
Hepg2. |
3. |
One hundred. |
16.7 |
0.3 |
1.7 |
5. |
0.3 |
n |
1250. |
0.5 |
HEP1A. |
20. |
One hundred. |
0.2 |
1.0 |
0.1 |
1 |
0.2 |
0.0 |
400 |
0.1 |
911. |
17. |
One hundred. |
11. |
0.2 |
0.1 |
17. |
0.1 |
n |
500. |
0.0 |
cho |
One hundred. |
One hundred. |
14. |
1.4 |
333. |
50. |
10. |
1.0 |
25000. |
5.0 |
cos |
33. |
One hundred. |
33. |
3.3 |
5.0 |
14. |
2.0 |
0.5 |
500. |
0.3 |
Mewo. |
10. |
One hundred. |
20. |
0.3 |
6.7 |
10. |
1.0 |
0.2 |
2857. |
1.0 |
nih3t3 |
10. |
One hundred. |
2.9 |
2.9 |
0.3 |
10. |
0.3 |
n |
500. |
0.1 |
A549 |
14. |
One hundred. |
20. |
n |
0.5 |
10. |
0.5 |
0.1 |
1000 |
0.1 |
HT1180 |
20. |
One hundred. |
10. |
0.1 |
0.3 |
33. |
0.5 |
0.1 |
333. |
0.2 |
单核细胞 |
1111. |
One hundred. |
n |
n |
125. |
1429. |
n |
n |
One hundred. |
n |
不成熟的DC |
2500. |
One hundred. |
n |
n |
222 |
2857. |
n |
n |
200. |
n |
成熟的DC. |
2222. |
One hundred. |
n |
n |
333. |
3333. |
n |
n |
One hundred. |
n |
注意:归一化到AAV-2 = 100的感染率率。ND =未确定
188金宝慱亚洲体育APP下载Signagen为试点血清型选择研究提供AAV Serotype测试套件(Cat#SL100886)。请记住,血清型选择研究不一致在体外和体内进行。
为什么rAAV感染介导了转基因的长期持久表达?
与野生型AAV不同,重组腺相关病毒(RAAV)载体通常不会将其转基因掺入宿主的基因组。然而,在感染宿主细胞后仍然能够介导长期基因表达。据报道,在啮齿动物肌肉中,rAAV载体基因组在核心中持续存在于主要的再生体形式中,其主要作为异常单体和上序圆圈存在。重组rAAV基因组用典型的核体模式同化到染色质中。静态组织持续多年的rAAV载体基因组和基因表达的持续存在表明,真染色质染色质结构对于再生体维持和转基因表达是重要的。这些发现是从用RAAV1和RAAV8载体转导的灵长类肌肉,在肌内递送5E + 12 Vg / kg(图3)后长达22个月。
图3.一种动画片,显示由RAAV感染介导的长期持续转基因表达的机械主义。
矢量准备的典型滴度是什么?
对于飞行员,中型和大尺度金博app的自定义RAAV生产服务,我们保证以通过QPCR测量的滴度> 1E + 13 Vg / ml。
如何存储重组AAV准备?
建议在收到RAAV后等分,并将储存在-800.C.一旦分解等分试样,它可以在4oC上储存两周。稳定性研究表明RAAV载体在4的温度下高度稳定0.c或更少。避免反复解冻和冻结。
物理和基因组颗粒之间有什么区别?
已经成功包装的RAAV粒子被称为基因组称为基因组颗粒,其能够转化它们与其接触的细胞与其接触的细胞,因此没有基因组包装的功能性和rAAV颗粒称为非功能性的物理粒子。
基因递送的优点是rav?
rav具有在分割和非分配细胞中具有广泛的热衷和具有最小免疫内的长期基因转移的潜力的能力产生高滴度病毒。